Dinámica de células inmunitarias desconvolucionada por un solo

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2285 (2023) Citar este artículo

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La máquina de perfusión normotérmica (NMP) ha surgido como una técnica innovadora de preservación de órganos. Es esencial desarrollar una comprensión de la composición de las células inmunitarias del órgano donante y sus cambios dinámicos durante la NMP. El objetivo era una caracterización integral de las (sub)poblaciones de células inmunitarias, el tráfico de células y la liberación de citoquinas durante la NMP hepática. El perfil del transcriptoma unicelular de hígados de donantes humanos antes, durante el NMP y después del trasplante muestra una abundancia de neutrófilos del receptor de quimiocinas CXC 1+/2+ (CXCR1+/CXCR2+), que disminuyó significativamente durante el NMP. Esto es paralelo a una gran salida de leucocitos pasajeros con predominio de neutrófilos en el perfundido. Durante la NMP, los neutrófilos pasan de un estado proinflamatorio a un fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado, mientras que aumentan los monocitos/macrófagos antiinflamatorios/tolerogénicos. En este documento describimos la dinámica del repertorio de células inmunitarias, los cambios fenotípicos de células inmunitarias y el predominio de los neutrófilos durante la NMP hepática, que potencialmente contribuyen a la respuesta inflamatoria. Nuestros hallazgos pueden servir como recurso para iniciar futuros estudios de intervención inmunológica.

El trasplante hepático (TH) es el único tratamiento definitivo para la enfermedad hepática terminal1,2,3. La escasez de órganos sigue siendo un factor limitante importante, ya que la demanda supera con creces la oferta. La necesidad de mejores tecnologías de conservación junto con mayores tasas de utilización en órganos de donantes con criterio extendido (ECD) alimentaron el desarrollo de la máquina de perfusión normotérmica (NMP). Por lo tanto, un órgano se perfunde continuamente en condiciones casi fisiológicas a 37 °C con concentrados de eritrocitos oxigenados y heparinizados complementados con nutrición y antibióticos y en un sistema estéril cerrado. NMP permite una evaluación integral de la calidad y función de los órganos durante la conservación ex vivo y puede servir como plataforma para el reacondicionamiento, tratamiento y reparación de órganos extracorporales2,4,5,6,7,8,9.

Muchos cientos de órganos han sido perfundidos con máquina con éxito y los resultados a corto plazo indican que la NMP podría ayudar a disminuir las tasas de descarte de órganos y contribuir a una selección adecuada de órganos aptos para el trasplante4,10,11,12. Sin embargo, aunque la función de los órganos en bruto se puede medir fácilmente, se sabe muy poco sobre el estado inmunitario de un órgano y sus leuccitotes residentes en los tejidos durante la NMP. En estudios experimentales de perfusión pulmonar y renal ex vivo, un gran número de leucocitos pasajeros se movilizan y se extravasan en el perfundido, lo que afecta la inmunogenicidad del injerto13,14. También se han publicado datos que sugieren la movilización de leucocitos pasajeros en el perfundido en NMP15 de hígado. Teniendo en cuenta la capacidad inflamatoria y la magnitud de las células inmunitarias intrínsecas del hígado, es de vital importancia una comprensión más profunda del impacto de la NMP en el estado de las células inmunitarias hepáticas y su dinámica durante la NMP. En este documento, se consideró que el mapeo detallado de leucocitos de pasajeros utilizando la tecnología de secuenciación de ARN unicelular de transcriptoma completo (scRNASeq)16 mejora significativamente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares, incluidos los circuitos inflamatorios durante la NMP hepática. En los últimos años, los estudios de scRNASeq tenían como objetivo evaluar la heterogeneidad celular de los hígados humanos en diversas condiciones, incluida la lesión por isquemia/reperfusión (IRI)17,18,19,20,21,22,23,24. Se aplicó un mapeo de células inmunitarias en serie en profundidad de ocho hígados de donantes humanos antes y al final de NMP para investigar específicamente la fuente de citocinas/quimiocinas inmunomoduladoras y la dinámica de la activación inmunitaria a nivel de una sola célula. Validamos y visualizamos nuestros hallazgos mediante tinción inmunofluorescente (IF) multiplex en biopsias de hígado. La correspondiente movilización de células inmunitarias se caracterizó mediante el fenotipado en muestras de perfusión en serie recogidas durante 26 NMP de hígado humano, así como mediante el perfilado y la cuantificación de citoquinas.

En este trabajo, el mapeo de células inmunitarias profundas muestra el predominio de neutrófilos en hígados de donantes humanos, que se movilizan en el perfundido temprano durante la NMP hepática. La evaluación del fenotipo y la dinámica del repertorio de células inmunitarias hepáticas, junto con los correspondientes patrones de comunicación de célula a célula, mejoran nuestra comprensión de la inmunología de los hígados normotérmicamente perfundidos por máquina.

En la Tabla 1 se presenta una descripción general de la población general del estudio (los datos individuales se proporcionan en la Tabla complementaria 1). La información detallada sobre los hígados de estudio y el análisis se proporciona como esquema de flujo de trabajo en la Fig. 1. La decisión de aplicar NMP se basó en una o una combinación de las siguientes indicaciones: (D) presunta baja calidad del órgano, (R) receptor quirúrgicamente complejo y /o (L) logística (archivo de datos de origen). El tiempo de NMP dependió del tiempo requerido para la evaluación y el tiempo objetivo para la cirugía2,4,25. La mediana del tiempo de NMP fue de 19,13 h (h) (rango intercuartílico (RIC) 11,56-21,64). La mediana del pico de aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (ALT) fue de 6410 U/l (IQR 2422–13,696) y 3194 U/l (IQR 1402–7791), la mediana del nivel de lactato a las 6 h fue de 12 mmol/l ( RIQ 18-180). La decisión de trasplantar o descartar un hígado se basó en los parámetros de perfusión definidos previamente2,4,25. Siguiendo criterios predefinidos (ver métodos), se trasplantaron 24 hígados después de NMP, mientras que diez se rechazaron debido a la incapacidad para mantener los valores de pH fisiológicos, la degradación inadecuada del lactato y los niveles altos de perfusión de AST/ALT.

Si bien en este estudio se incluyeron un total de 34 hígados de donantes y se sometieron a NMP, ocho de los 34 hígados de donantes se seleccionaron aleatoriamente para scRNASeq y 26 de 34 para muestras de perfusión. Además, se recolectaron muestras de tejido en los 34 hígados para evaluar y validar los hallazgos en el nivel de proteína. Se proporciona información sobre los puntos de tiempo de muestreo, el análisis, el donante y el estado del trasplante de los órganos. FFPE fresco congelado incluido en parafina, perfusión de máquina normotérmica NMP, reperfusión RP, inmunofluorescencia IF, inmunohistoquímica IHC, donante DBD después de muerte cerebral, donante DCD después de muerte circulatoria.

La mediana del modelo de receptor para la enfermedad hepática en etapa terminal (MELD) y la puntuación del balance de riesgo (BAR) fue de 14 (IQR 11-18) y 7 (IQR 7-10). La mediana de edad del receptor fue de 60 años (RIC 55-68). La mediana de estancia en unidad de cuidados intensivos (UCI) y total hospitalaria fue de 5 (RIC 3-9) y 21 días (RIC 15-30). Nueve pacientes (37%) desarrollaron disfunción temprana del injerto (EAD). Se produjeron complicaciones de grado > 3 de Clavien-Dindo en 11 (46 %) pacientes. Tres pacientes fallecieron de sepsis fúngica, uno de sepsis por Clostridium difficile y uno después de colangiosepsis. La supervivencia del injerto censurada por muerte fue del 100% (tabla 2).

Como primer paso, el repertorio general de células inmunitarias de ocho hígados de donantes sometidos a NMP se caracterizó antes de la NMP (T0), al final de la NMP (T1) y después de la reperfusión (T2) utilizando el perfil scRNASeq (Fig. 2A). Anotamos las poblaciones de células más relevantes utilizando agrupaciones no supervisadas (Fig. 2B). Nuestros análisis describen la composición celular y la dinámica de expresión génica de todos los tipos de células hepáticas que componen el parénquima, incluidas las células inflamatorias del hígado. Si bien todo el conjunto de datos está disponible y el fenotipo de expresión génica y la dinámica de las células constituyentes son interesantes y relevantes, el enfoque de este estudio fueron los cambios dinámicos de las células inflamatorias hepáticas durante la perfusión ex vivo de hígados de donantes humanos.

Una descripción general del flujo de trabajo de scRNASeq. Se indican las proporciones de células epiteliales (KRT18), leucocitos (PTPRC/CD45) y células endoteliales (SPARC) en el conjunto de datos de scRNASeq obtenido. B Gráfica de aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) de 118 448 celdas individuales, codificadas por colores según el tipo de celda. C Composición relativa de tipos de células en tejidos hepáticos de ocho pacientes individuales. Gráficos D UMAP, codificados por colores para la expresión de los genes marcadores específicos del tipo de célula indicado (puntas de flecha rojas). E Niveles de expresión génica de marcadores específicos de tipo celular. F La proporción de poblaciones de leucocitos en tejido hepático determinada por scRNASeq frente a citometría de flujo. Gráfico G UMAP coloreado por el número de transcritos por celda. La escala de color se recorta en 20.000. H Diagrama de caja del recuento de transcritos por tipo de célula. Los valores denotan el promedio por paciente (n = 8). La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartílico (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR.

Los genes marcadores se analizaron para anotar tipos de células específicos, como neutrófilos (FCGR3B), monocitos/macrófagos (CD68), células T CD3+ (CD3E), células T CD4+ (CD4), células T CD8+ (CD8A), células T reguladoras (Tregs ) (FOXP3), células asesinas naturales (NK) (NKG7), células dendríticas (FLT3), células progenitoras (CD24), células B (CD79A), células plasmáticas (JCHAIN), hepatocitos (ALB), células endoteliales (FLT1) y colangiocitos (KRT19; Fig. 2D, E, Fig. 2 complementaria). Para garantizar una interpretación sólida de los datos, nos enfocamos en las firmas de genes marcadores para definir tipos de células distintivos, lo que corroboró la validez de nuestro proceso de anotación (archivo de datos de origen).

Si bien se observó cierta heterogeneidad entre pacientes, la composición celular general fue comparable entre los órganos (Fig. 2C, Fig. 3A, B complementarias). Los neutrófilos se identificaron como el principal grupo de células inmunitarias en todos los pacientes (48,7 %; 57 564 células), y el linaje de monocitos/macrófagos como el segundo tipo de célula inmunitaria más dominante en el hígado (7,75 %; 18 682 células; Fig. 2C; individuo pacientes ver el archivo de datos de origen). En concordancia, la inmunohistoquímica (IHC) mostró neutrófilos (CD15) y monocitos/macrófagos (CD68) como poblaciones de leucocitos residentes dominantes en el tejido hepático (Fig. 4 complementaria). La proporción de leucocitos identificados por scRNASeq fue validada por citometría de flujo en las muestras correspondientes (Fig. 2F).

Los neutrófilos se definieron por un contenido de ARNm excepcionalmente bajo y, por lo tanto, por un número relativamente bajo de transcritos detectados por célula (Fig. 2G, H; las métricas de control de calidad adicionales se muestran en la Fig. 3D, E complementaria). Recientemente hemos demostrado que, en comparación con otras plataformas scRNASeq, el flujo de trabajo de BD Rhapsody captura una cantidad notablemente alta de moléculas de ARNm por célula y, por lo tanto, puede ser particularmente adecuado para representar células con bajo contenido de ARNm26. Por lo tanto, debido a la cantidad relativamente alta de moléculas de ARNm capturadas por célula, se identificaron neutrófilos con un contenido de ARNm relativamente bajo en nuestro conjunto de datos scRNASeq (Fig. 2H; nCount_RNA medio: 4106; nCount_RNA medio en neutrófilos: 2050) pero no en los publicados anteriormente. conjuntos de datos

En resumen, el atlas de células inmunitarias se basa en un total de 21 muestras de biopsia recolectadas de ocho hígados de donantes humanos antes, al final de la NMP y después de la reperfusión. Nuestros análisis desconvolucionan la composición celular y representan neutrófilos previamente no reconocidos con una resolución unicelular.

Con el fin de investigar el impacto de la NMP en el panorama de las células inmunitarias del hígado, evaluamos las diferencias en los perfiles de scRNASeq de muestras de biopsias en serie tomadas antes de la NMP (T0) y al final de la NMP (T1) (Fig. 3A; número de células de cada célula). tipo en T0 y T1 se muestran en el archivo de datos de origen).

Un gráfico UMAP de 90 404 células individuales (solo muestras T0 y T1), codificadas por colores según el tipo de célula. B Composición relativa del tipo celular en tejidos hepáticos antes (T0) y al final de (T1) NMP. C Gráfica UMAP de 90 404 celdas individuales, codificadas por colores por punto de tiempo [pre (T0) y al final de (T1) NMP]. Los grupos de monocitos/macrófagos (1) y neutrófilos (2) están resaltados. D Imágenes de inmunofluorescencia múltiplex de marcadores inmunológicos presentados solos y junto con pan-citoqueratina y el mapa de fenotipado antes (T0) y al final de (T1) NMP. El mapa de fenotipado se generó en InForm, cada punto de color representa un fenotipo de la célula, puntos negros: otras células de fenotipo desconocido. Las imágenes se muestran con un aumento de ×20 (barra de escala: 100 µm). E, F Densidades celulares (número de células/mm2) para marcadores inmunológicos individuales en 10 pacientes. El panel superior E presenta los valores para cada hígado individual antes (T0) y al final de (T1) NMP. El panel inferior F presenta un análisis estadístico de columna para cada biomarcador (n = 10, prueba t pareada, dos colas, media ± SEM, **p = 0,0097).

Lo más sorprendente es que la proporción de neutrófilos disminuyó con el tiempo de perfusión, mientras que la proporción de monocitos/macrófagos, células T y células B cambió solo marginalmente durante la NMP (Fig. 3B). El uso de la tinción IF multiplex de varias células inmunitarias en biopsias recolectadas de 10 hígados adicionales confirmó estos hallazgos: la NMP no afectó notablemente el número y la distribución de monocitos/macrófagos (CD68), células T (CD3 y CD8) y células B (CD20) , mientras que el número absoluto de neutrófilos (CD15) disminuyó significativamente (p < 0,001) con el tiempo (Fig. 3D-F), a pesar de que los neutrófilos permanecieron prominentes durante todo el período de perfusión (Fig. 3B, D-F).

Curiosamente, NMP indujo un cambio notable en el perfil transcriptómico de neutrófilos y monocitos/macrófagos (Fig. 3C), mientras que el nivel de estrés celular definido por la cantidad relativa de transcritos mitocondriales detectados (%MT, Fig. 5A complementaria) y la expresión génica los niveles de un conjunto de transcripciones importantes relacionadas con el estrés y la apoptosis (Fig. 5B complementaria) no se vieron notablemente afectados por la NMP. En resumen, la NMP reduce significativamente la cantidad y la proporción de neutrófilos hepáticos durante el tiempo de perfusión, mientras que otros tipos principales de células inmunitarias no se ven afectados de forma marcada.

Luego evaluamos la firma transcriptómica de los neutrófilos que comprenden la mayor población de células inmunitarias intrahepáticas y anotamos subpoblaciones para investigar el impacto de NMP en la expresión génica y los cambios de fenotipo con mayor detalle. La Figura 4A muestra genes marcadores conocidos en neutrófilos, incluidos IFITM2, CSF3R, FPR1, FCGR3B, VNN2, G0S2, CXCR2 y SOD2. CXCR2 es de particular interés, ya que se expresa predominantemente en el grupo de neutrófilos (Fig. 4B, C; los datos de biopsia y pacientes individuales se muestran en la Fig. 6A complementaria). Observamos un patrón de expresión comparable para CXCR1 (Fig. 4C, Fig. 6B complementaria). Por lo tanto, NMP resultó en una reducción significativa de los niveles de expresión de los genes CXCR2 y CXCR1 (Fig. 4D). Validamos la expresión de la proteína correspondiente del receptor de quimiocinas CXC (CXCR) 2 en neutrófilos mediante tinción IF multiplex de 10 hígados antes y al final de NMP (Fig. 4E). De manera similar a la disminución del número de neutrófilos (Fig. 3D-F), la expresión de la proteína CXCR2 en los neutrófilos se redujo significativamente durante NMP (Fig. 4F). En paralelo, la expresión del ARNm de CXCR4 se elevó notablemente durante la NMP, lo que indica un aumento potencial en la proporción de neutrófilos agotados/envejecidos (Fig. 4D)27.

A Niveles de expresión génica de genes específicos de neutrófilos en tipos de células individuales. B Niveles de expresión del gen CXCR2 en tipos de células individuales. Cada punto representa la media de un paciente (n = 8). Gráficos C UMAP de 41 177 neutrófilos, codificados por colores por punto de tiempo y los niveles de expresión de los genes CXCR2, CXCR1 y CXCR4. D Niveles de expresión génica de CXCR2, CXCR1 y CXCR4 en neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP. Cada punto representa la media de un paciente (n = 7). Las tasas de descubrimiento falso (FDR) se determinaron mediante un análisis pseudo-masivo con DESeq2. E Tinción inmunofluorescente de CXCR2 y CD15 pre (T0) NMP. Las imágenes se muestran con un aumento de ×20 (barra de escala: 100 µm, n = 10, para cada muestra se tomaron 4 imágenes representativas). F Densidad celular (número de células/mm2) de células CXCR2+ antes (T0) y al final de (T1) NMP. El gráfico superior presenta los valores para cada hígado individual, el gráfico inferior es un análisis estadístico de columna (n = 10, prueba t pareada, dos colas, media ± SEM, *p = 0,02). Nivel de expresión del gen G CXCL8 en neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP. Cada punto representa la media de un paciente (n = 7). Las tasas de descubrimiento falso (FDR) se determinaron mediante un análisis pseudo-masivo con DESeq2. Gráfica H UMAP de 90 404 células individuales (solo muestras T0 y T1), coloreadas por la expresión del gen CXCL8. Los grupos de monocitos/macrófagos (1) y neutrófilos (2) están resaltados. I Señalización diferencial de los neutrófilos a otros tipos de células. Panel superior: ligandos de neutrófilos expresados ​​diferencialmente en T0 frente a T1 (prueba de Wald DESeq2 bilateral en pseudobulto, los valores de p se ajustaron a la tasa de descubrimiento falso (FDR)). Los colores rojos indican regulación positiva en T1 en comparación con T0. Panel inferior: Receptores respectivos y la expresión por tipo de célula. Los tamaños y colores de los puntos se refieren a la fracción de células que expresan el receptor y la expresión génica, respectivamente, promediados entre todos los pacientes. Los puntos solo se muestran para los receptores que se expresan en al menos el 10% de los tipos de células respectivos. En todos los diagramas de caja, la línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartílico (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR.

El impacto de NMP en la firma genética de los neutrófilos se evaluó aún más mediante el análisis de genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) (T0 frente a T1; los DEG regulados y seleccionados superior se muestran en la Fig. 6C complementaria). Identificamos una regulación positiva significativa de CXCL8/IL-8 en el grupo de neutrófilos durante NMP (Fig. 4G; archivo de datos de origen). CXCL8 es un ligando proinflamatorio afín para CXCR2 y CXCR1 y que media la activación de neutrófilos y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)28. Los neutrófilos y, en menor medida, los monocitos/macrófagos fueron las fuentes principales para la producción de CXCL8 (Fig. 4H). En consecuencia, el análisis de las redes de comunicación de célula a célula utilizando CellChat29 indicó la activación de neutrófilos autocrinos (Fig. 4I), así como la activación de neutrófilos desencadenada por monocitos/macrófagos (ver más abajo) a través de la señalización CXCL8-CXCR1/CXCR2 durante NMP, respectivamente.

El perfil transcripcional de los neutrófilos al final de NMP se parecía a un fenotipo que identificamos y caracterizamos recientemente como neutrófilos envejecidos/activados crónicamente/agotados en tejidos tumorales de cáncer de pulmón de células no pequeñas (Fig. 5A: expresión reducida de CXCR1, CXCR2, PTGS2, SELL, y expresión elevada de CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1)26. La regulación positiva de VEGFA (Fig. 5A, Fig. 6C complementaria), así como los patrones elevados de comunicación celular VEGFA-KDR1/FLT1 desde los neutrófilos hacia las células endoteliales (Fig. 4I), sugieren que durante la reparación del tejido NMP se induce a través de la revascularización de tejido dañado.

A Expresión de genes marcadores seleccionados en neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP en pacientes individuales (n = 7). La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartílico (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR. Prueba de Wald DESeq2 de dos caras en pseudobulto, los valores p se ajustan a la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando la ponderación de hipótesis independiente (IHW). B UMAP de neutrófilos coloreados por subgrupos (N0, N1, N2, N3). C Expresión de genes marcadores seleccionados en subgrupos de neutrófilos. D Composición relativa de los subgrupos de neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP. E Actividad diferencial del factor de transcripción (TF) por tipo de célula en T0 frente a T1 calculada con DoRothEA. El rojo indica la regulación al alza de un regulón TF en T1 en comparación con T0. Los valores de p se determinaron utilizando una prueba t de dos caras y se ajustaron para la tasa de descubrimiento falso (FDR). Las estadísticas t se calcularon utilizando un modelo lineal multivariante implementado en desacoplador-py. F Análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes (ORA) de conjuntos de genes "Hallmark" seleccionados por tipo de célula en T0 frente a T1. Un valor de p pequeño indica que, entre los genes del conjunto de genes, se expresan diferencialmente más genes de lo esperado por casualidad (prueba exacta de Fisher de una cola).

A continuación, separamos los neutrófilos mediante el agrupamiento de Leiden sin supervisión en cuatro subconjuntos (N0–N3; Fig. 5B; los genes regulados superiores se muestran en el archivo de datos de origen), que fue respaldado por todos los pacientes (Datos complementarios 6D). El grupo N0 se caracterizó por la expresión de genes proinflamatorios que inducen la migración de neutrófilos a sitios de inflamación (S100A12, S100A8, S100A9, MMP8, MMP9)30,31,32, el cofactor de NETosis PADI433, así como genes involucrados en adhesión celular mediada por integrinas (ITGAM, ITGA1, ITGA6). Por lo tanto, el grupo N0 representa un fenotipo de neutrófilo altamente activado proinflamatorio. El grupo N1 era bastante similar al grupo N0, pero mostraba una expresión elevada de ITGA4 y de TAFA4, que modula las funciones de reparación del tejido de los macrófagos34 (Fig. 5C, archivo de datos de origen). En particular, la proporción de neutrófilos N0 y N1 proinflamatorios disminuyó claramente durante el curso de NMP, mientras que los neutrófilos N2 se enriquecieron notablemente (Fig. 5D). El grupo N2 se parecía al fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado descrito anteriormente (CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1, VEGFA). Los neutrófilos N2 también expresaron OLR1 (Fig. 5C, archivo de datos de origen), un marcador que identificamos recientemente en neutrófilos asociados a tumores crónicamente activados26. En concordancia, el análisis de actividad del factor de transcripción (TF) reveló que NMP desencadenó una inducción significativa de PPARG (Fig. 5E), un regulador transcripcional directo de OLR135. El grupo N3 mostró una alta expresión de genes mitocondriales (MT-CYB, MT-ND4, MT-ATP6), lo que indica el inicio de la apoptosis celular, así como genes involucrados en la respuesta de fase aguda (SAA1, SAA2) y señalización de interferón (IFIT1, IFIT2)36 (Fig. 5C, archivo de datos de origen). En particular, los neutrófilos N3 disminuyeron durante NMP (Fig. 5D).

En conjunto, nuestros hallazgos indican que la NMP cambia los neutrófilos de un estado proinflamatorio activado a un fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado en hígados humanos, lo que sugiere una atenuación de los procesos inflamatorios agudos desencadenados por los neutrófilos durante la NMP.

Para evaluar las asociaciones entre los perfiles de expresión de distintas poblaciones celulares y conjuntos de genes seleccionados indicativos de procesos y vías celulares, se realizaron análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) (Fig. 5F). Se reconocieron en los neutrófilos varias vías implicadas en las respuestas inflamatorias, la apoptosis y las actividades supresoras de tumores. Los monocitos/macrófagos señalaron las vías implicadas en las funciones efectoras del complemento. La activación del complemento está involucrada en los procesos inflamatorios crónicos, pero también respalda un microambiente inmunosupresor e induce la angiogénesis y la reparación de tejidos37. Estos hallazgos sugieren un cambio hacia los monocitos/macrófagos con propiedades antiinflamatorias, cicatrizantes y regeneradoras de tejidos.

Dado que los monocitos/macrófagos tienen una función reguladora clave en las respuestas inflamatorias hepáticas, evaluamos su fenotipo con mayor detalle. Los monocitos/macrófagos caracterizados por la expresión del marcador de superficie celular CD68 se alteraron significativamente en su perfil transcriptómico durante la NMP (Figs. 3C, 6A, Fig. 7A complementaria; Fig. 6B: genes marcadores conocidos en células de monocitos/macrófagos CST3, CTSB, MS4A7, MARCH1 , CD68, MAFB, CD163, VCAN y CSF1R)38,39. La expresión elevada de CXCL8 en monocitos/macrófagos (Fig. 4H) y la inducción significativa de quimiocinas proinflamatorias CCL2 y CCL3 (DEG superior seleccionado en células de monocitos/macrófagos antes y al final de NMP se muestran en la Fig. 7C complementaria) indican que durante NMP, el fenotipo de monocitos/macrófagos cambia hacia un estado proinflamatorio. El análisis de comunicación célula-2-célula indicó una señalización fuertemente elevada de SPP1 (osteopontina) hacia sus receptores afines (por ejemplo, CD44) expresados ​​en una variedad de células inmunitarias (Fig. 6G). La osteopontina afecta la inflamación aguda y crónica, ya que regula la migración, la polarización y la activación de las células inmunitarias40. Contrariamente a la estimulación proinflamatoria, NMP disminuyó la expresión de genes clave que caracterizan el estado inflamatorio de monocyes/macrófagos (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA, CSTA, CD74) y elevó el nivel de expresión de marcadores asociados a un fenotipo tolerogénico (CD163, MARCO, HMOX1, VSIG4, NSMAF, CTSB, VMO1; Fig. 6B y Fig. 7C complementaria)17. Tradicionalmente, los macrófagos se clasifican como inflamatorios o inmunorreguladores41. La expresión del gen VSIG4 media la tolerancia de las células T y las células T asesinas naturales (NKT) durante la lesión hepática inmunomediada42. De manera similar, la caída de HMOX1 (hemoxigenasa) en ratones conduce a una inflamación hepática43. Mac Parland et al. demostraron que la expresión de MARCO está predominantemente elevada en macrófagos humanos no inflamatorios17.

A UMAP-parcelas de 13.720 monocitos/macrófagos, codificados por colores por punto de tiempo [pre (T0) y al final de (T1) NMP], y del nivel relativo de expresión del gen CD68. B Niveles de expresión génica de marcadores inflamatorios (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA) y marcadores tolerogénicos (CD163, MARCO, HMOX1 y VSIG4) en monocitos/macrófagos antes (T0) y al final de NMP (T1). Cada punto representa la media de un paciente (n = 7). Las tasas de descubrimiento falso (FDR) se determinaron mediante un análisis pseudo-masivo con DESeq2. La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartílico (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR. C Niveles de expresión génica de genes específicos de monocitos/macrófagos. D UMAP de monocitos/macrófagos coloreados por subgrupos (M0, M1, M2, M3). E Expresión de genes marcadores seleccionados en subgrupos de monocitos/macrófagos. F Composición relativa de los subgrupos de monocitos/macrófagos antes (T0) y al final de (T1) NMP. G Señalización diferencial de monocitos/macrófagos a otros tipos de células. Panel superior: Ligandos expresados ​​diferencialmente de monocitos/macrófagos en T0 frente a T1 (prueba de Wald DESeq2 de dos caras en pseudobulto, los valores de p se ajustaron a la tasa de descubrimiento falso (FDR)). Los colores rojos indican regulación positiva en T1 en comparación con T0. Panel inferior: Receptores respectivos y la expresión por tipo de célula. Los tamaños y colores de los puntos se refieren a la fracción de células que expresan el receptor y la expresión génica, respectivamente, promediados entre todos los pacientes. Los puntos solo se muestran para los receptores que se expresan en al menos el 10% de los tipos de células respectivos. Solo se muestran los ligandos regulados al alza. La lista de interacciones reguladas a la baja está disponible en el archivo de datos de origen.

Para diseccionar aún más la plasticidad de los monocitos/macrófagos durante la NMP, realizamos un agrupamiento de Leiden sin supervisión e identificamos cuatro subconjuntos distintivos (M0 a M3) (Fig. 6D, Fig. 6E; los genes marcadores regulados superiores se muestran en el archivo de datos de origen) en todos los hígados (Fig. 7D complementaria). El subgrupo M0 mostró una alta expresión de varios genes proinflamatorios, lo que sugiere que este grupo representa monocitos/macrófagos inflamatorios (LYZ, VCAN, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA). De acuerdo con el análisis DEG, la proporción de monocitos/macrófagos M0 proinflamatorios se redujo fuertemente durante NMP (Fig. 6F). El subgrupo M1 fue sorprendentemente similar a una población de macrófagos C1Q+ informada con frecuencia (C1QB, MRC1, HLA-DOA, FOLR2)44. La regulación positiva observada de los genes relacionados con la vía del complemento (C1QB, C1QC, AXL) sugiere un papel potencial del subgrupo M1 en la eliminación del tejido lesionado a través de la eferocitosis45,46. Por el contrario, el grupo M2 mostró un perfil de expresión génica comparable a los monocitos no clásicos (CDKN1C, CYFIP2)47,48, así como una alta expresión de CX3CR1, un marcador que define a los monocitos que se alojan constitutivamente en los tejidos y contribuyen a la reparación y reparación de los mismos. cicatrización de heridas 49. Si bien los subgrupos M1 y M2 no cambiaron notablemente durante NMP, el grupo M3 aumentó significativamente (Fig. 6F). Este subgrupo se caracterizó por la expresión de marcadores predominantemente asociados con macrófagos activados alternativamente ("similares a M2"). Los macrófagos similares a M2 inducen la proliferación celular y la angiogénesis, pero también participan en la eliminación de restos celulares y fomentan la reparación de tejidos (PLAU, CXCL5, CFS1, FPR3, SPP1, CTSL, IL4I1, HS3ST1, SERPINB2, SLC7A11)50,51,52,53, 54,55,56,57,58,59,60,61. El subgrupo M3 también expresó FN1 (fibronectina), que participa en la formación de matriz extracelular y en los mecanismos de reparación de heridas62. Es de destacar que el análisis de comunicación célula-2-célula en monocitos/macrófagos indicó una señalización elevada de FN1, por ejemplo, hacia su receptor afín ITGB1 expresado en colangiocitos (Fig. 6G). Además, se identificaron numerosos marcadores antiinflamatorios en el grupo M3: los marcadores PHLDA1, MMP19, FABP5, NRP1, NRP2, RASGRP3, DHRS9, MT1H indican una posible atenuación de la producción de citoquinas proinflamatorias63,64,65,66,67 ,68,69,70,71.

En resumen, nuestros datos mostraron que la inducción de fabricantes proinflamatorios y un fenotipo proinflamatorio general de monocitos/macrófagos se acompaña de la inducción de subtipos de células antiinflamatorias y tolerogénicas ("similares a M2") que contribuyen a la proliferación celular. angiogénesis, cicatrización de heridas y reparación de tejidos.

Después de definir el panorama unicelular de las células inmunitarias residentes en tejidos durante la NMP, a continuación nos centramos en el compartimento de perfusión. Por lo tanto, investigamos la dinámica de las células inmunitarias en la perfusión de 26 hígados adicionales y vinculamos estas observaciones con alteraciones de las células inmunitarias intrahepáticas durante la NMP (Fig. 7A). La viabilidad celular se confirmó en una serie de muestras de perfusión (Fig. 7B). Tan pronto como 1 hora después del inicio de la NMP, se observó un rápido aumento del número absoluto de leucocitos CD45+ (2537/µl [2003, 3215]). Los subconjuntos dominantes fueron granulocitos CD45+HLA-DRlow (1947/µl [1510, 2511]), células T CD45+CD3+ (203/µl [157, 263]), células NK CD45+CD56+ (99/µl [68, 143 ]), células B CD45+CD19+ (52/µl [38, 71]) y monocitos/macrófagos CD45+CD14+ (37/µl [26, 54]) (Fig. 7C, D). El análisis de regresión indicó un cambio estadísticamente significativo en el número absoluto de células durante el tiempo de perfusión para todos los subtipos de leucocitos. Mientras que las células B CD45+CD19+ y los monocitos/macrófagos CD45+CD14+ alcanzaron su punto máximo a las 6 h, se observó una disminución en el número total de leucocitos para todos los subconjuntos más allá de las 6 h de NMP (Fig. 7E, F, Tabla complementaria 2).

Un flujo de trabajo de análisis de perfusión de NMP y métodos aplicados. Las pruebas de viabilidad de células B antes de la citometría de flujo (n = 3 pre, a 1 h NMP y al final de NMP) mostraron solo un porcentaje muy pequeño de células no viables en el perfundido. C Cantidades absolutas de leucocitos CD45+ para los principales subtipos de células inmunitarias en el perfundido circulante total (media ± SEM) y composición D a 1 h NMP. E, F Cambio dinámico de leucocitos CD45+ totales y principales subtipos durante NMP. G Cambio dinámico de los subtipos de células T CD3+ (proporciones) durante el tiempo de perfusión. Los gráficos muestran los efectos marginales. Los valores se estiman mediante análisis de regresión lineal. Los valores p se refieren al cambio en el tiempo. Las medias de mínimos cuadrados calculadas mediante un modelo lineal se muestran junto con el IC del 95 %. N = 26 muestras biológicamente independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Células NK, células asesinas naturales, células NKT, células T asesinas naturales, células MAIT, células T invariantes asociadas a la mucosa.

La proporción de neutrófilos identificados en el atlas de células inmunitarias de scRNASeq y la tinción de IF en el tejido hepático disminuyó con el tiempo de NMP, mientras que se encontró un alto número absoluto de neutrófilos en el perfundido. Estos hallazgos correspondientes indican una rápida migración de neutrófilos al perfundido. Esto también es válido, aunque en menor medida, para otras células inflamatorias. Estos cambios celulares se corresponden con los patrones de las células inmunitarias obtenidas en biopsias de hígado con respecto a sus patrones y dinámicas cuantitativas básicas. En resumen, se encontró una migración rápida y significativa principalmente de neutrófilos al perfundido.

Además, caracterizamos los subtipos de las principales poblaciones de células inmunitarias y sus cambios dinámicos en cinco muestras de perfusión en serie mediante citometría de flujo. A la hora de NMP, los subconjuntos de células T CD45+CD3+ en el perfundido comprendían un 48 % [42, 54] de células T auxiliares CD3+CD4+, mientras que un 44 % [37, 50] eran células T citotóxicas CD3+CD8+. La proporción de ambos subconjuntos cambió significativamente a favor de las células auxiliares T CD4+ durante el tiempo de perfusión. Los linfocitos CD3+CD56+ NKT y el receptor de linfocitos T CD3+ (TCR) Vα2.2+CD161+ linfocitos T invariantes asociados a la mucosa (MAIT) representaron solo pequeñas proporciones del total de linfocitos T sin una dinámica relevante durante el tiempo de perfusión (fig. 7G). Las proporciones de células T de memoria CD3+CD4+ cambiaron significativamente durante el tiempo de perfusión (Fig. 8A), mientras que las células T de memoria CD3+CD8+ permanecieron estables (Fig. 8B). CD4+CD25+FoxP3+ Tregs comprendían el 2,32 % [1,58, 3,28] de la población de células T a la hora. En particular, su proporción aumentó significativamente durante el tiempo de perfusión al 4,71% [3,29, 6,59] a las 24 h NMP (Fig. 8C). Las células NK CD45+CD56+ eran en su mayoría CD56dimCD16+ (94,21 % [96,11, 91,58] sin cambios significativos a lo largo del tiempo (Fig. 8D). Entre los monocitos/macrófagos CD14+CD16+, las células de Kupffer CD14+CD64+CD163+ comprendían solo una pequeña proporción en el perfundido a 1 h (5,56 % [3,39, 8,78]), pero se observó un fuerte aumento proporcional con la perfusión prolongada (24 h NMP: 11,86 % [7,05, 19,52], Fig. 8E). Entre los subtipos numéricamente prominentes (es decir, CD45+HLA -DRlow granulocitos), los neutrófilos CD15+CD16+ dominaban (93,45 %% [88,90, 96,30]) sobre muy pocos eosinófilos Siglec-CD8+CD16- (0,38 % [0,20, 0,59]) y basófilos CD16+CD123+ (0,23 % [ 0.13, 0.34]) a 1 h NMP. Sus proporciones permanecieron sin cambios a lo largo del tiempo (Fig. 8F). Las células dendríticas representaron solo una pequeña proporción de los leucocitos totales (0.86% [0.53, 1.27] a 1 h NMP) sin una dinámica significativa durante NMP (Fig. 8G, Tabla complementaria 3).

Los perfundidos recolectados en varios momentos durante la NMP (n = 26 hígados sometidos a NMP) se evaluaron en cuanto a los cambios dinámicos de las proporciones de A células T CD4+, B células T CD8+, C subtipos de células T CD3+ con propiedades reguladoras, D CD56+ NK células, E CD45+CD14+ monocitos/macrófagos, F CD45+HLA-DRlow granulocitos y G células dendríticas. Los gráficos muestran los efectos marginales. Los valores se estiman mediante análisis de regresión lineal. Los valores p se refieren al cambio en el tiempo. Las medias de mínimos cuadrados calculadas mediante un modelo lineal se muestran junto con el IC del 95 %. N = 26 muestras biológicamente independientes. Niveles de expresión génica de los factores proinflamatorios indicados (interleucinas/quimiocinas) en monocitos/macrófagos y neutrófilos antes (T0) y al final de NMP (T1) evaluados mediante scRNASeq en ocho donantes de hígado. I Espectro de interleucinas/quimiocinas proinflamatorias evaluadas producidas por monocitos/macrófagos y neutrófilos y elevadas en el nivel de proteína en muestras de perfusión recolectadas durante el tiempo de perfusión de 26 hígados de donantes. (J) Niveles de expresión génica de IL-6 y TNF en monocitos/macrófagos y neutrófilos antes (T0) y al final de NMP (T1) evaluados por scRNASeq en hígados trasplantados (n = 6) y descartados (n = 2) . La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartílico (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR. Además, en el perfundido de 26 hígados de donantes sometidos a NMP se midieron los niveles de IL-6 y TNF a 1, 4, 6, 12 y 24 h de NMP y las diferencias entre trasplantados (n = 18) y descartados (n = 8) se calcularon los hígados. Los gráficos muestran los efectos marginales. Los valores se estiman mediante análisis de regresión lineal. Los valores p se refieren al cambio en el tiempo. Las medias de mínimos cuadrados calculadas mediante un modelo lineal se muestran junto con el IC del 95 %. N = 26 muestras biológicamente independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Tcm: linfocitos T de memoria central, Tem: linfocitos T de memoria efectores, Temra: linfocitos T de memoria efectores que reexpresan linfocitos T CD45RA, DN linfocitos T: linfocitos T doble negativos (CD4- y CD8-), linfocitos NK Células asesinas naturales, DC células dendríticas.

Estos datos destacan la movilización de un amplio espectro de leucocitos en el perfundido circulante durante la NMP. El análisis de muestras en serie tomadas durante el transcurso del período de NMP de 24 h reveló una dinámica de migración distinta. Si bien la migración de varios subtipos de células inmunitarias al perfundido apareció muy rápidamente, la movilización y liberación de células Tregs y Kupffer aumentó tan pronto como 12 h después de la NMP.

A continuación, investigamos los niveles de expresión génica de interleucina/quimiocina en células inmunitarias y los niveles de proteína en muestras de perfusión en serie. Mientras que los monocitos/macrófagos expresaron cada vez más IL1B, IL18, CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4 y TNF proinflamatorios, los neutrófilos expresaron principalmente CXCL8 y, en menor medida, IL1B y CXCL1 (Fig. 8H). La expresión de marcadores antiinflamatorios como IL10 fue inducida en monocitos/macrófagos (Fig. 8H)72.

De acuerdo con el conjunto de datos transcriptómicos, las citocinas proinflamatorias expresadas en monocitos/macrófagos y neutrófilos también aumentaron en el perfundido con el tiempo, lo que denota una mayor transcripción y liberación de proteínas en el microambiente hepático y el perfundido (Fig. 8I). La Figura 8 complementaria muestra la dinámica de todas las citocinas/quimiocinas en el nivel de proteína durante el tiempo de perfusión (los valores respectivos se proporcionan en la Tabla 4 complementaria). Solo se encontraron alteraciones leves en las firmas transcriptómicas de las células T y NK (Fig. 9 complementaria).

Se evaluó con más detalle el impacto del tipo de donante (donación después de la muerte cerebral [DBD] frente a DCD) y la idoneidad para el trasplante (hígados trasplantados frente a descartados) en la dinámica de las citoquinas de proteínas. La mayoría de las citocinas perfundidas aumentaron con el tiempo de perfusión prolongado en todos los grupos. Las concentraciones de IL-6 fueron más significativamente elevadas en el perfundido de los injertos DCD en comparación con los injertos DBD (p = 0.05, Fig. 10 complementaria, Tabla 5 complementaria). Este fenómeno también se observó al comparar hígados descartados con hígados trasplantados (p = 0.032, Fig. 8J, Fig. 10 complementaria, Tabla 6 complementaria). En concordancia, encontramos una expresión elevada de IL6 en monocitos/macrófagos a nivel transcripcional, lo que indica que este tipo de células contribuye al menos sustancialmente a la producción de IL-6 (Fig. 8J). Además de IL-6, también el factor de necrosis tumoral (TNF) aumentó significativamente en el perfundido al comparar hígados desechados frente a trasplantes (p = 0,012, Fig. 8J, Fig. 11 suplementaria, Tabla 6 suplementaria).

En conjunto, nuestros datos sugieren que la respuesta inmunológica durante la NMP hepática varía entre los tipos de donantes y los injertos de "baja calidad" (no aptos para trasplante) frente a los "aceptables".

La NMP ex vivo de órganos humanos es una herramienta clínica que avanza rápidamente para mejorar y prolongar la conservación de órganos. Además, la capacidad de evaluar la función antes del trasplante aborda una necesidad insatisfecha y ofrece una posibilidad única de dilucidar los eventos moleculares durante la reperfusión. Esta tecnología también puede sentar las bases para el futuro tratamiento específico de órganos ex vivo. Dado que el hígado contiene una gran cantidad de células inmunitarias con importantes funciones inmunorreguladoras y de importancia central para una función hepática adecuada73, caracterizamos en profundidad las (sub)poblaciones de células inmunitarias en hígados de donantes humanos y perfundidos durante NMP y evaluamos las citoquinas perfundidas. El mapeo profundo de células inmunitarias indicó un predominio de neutrófilos en los hígados del donante, que se movilizan rápidamente en el perfundido durante la NMP. Los neutrófilos transitan desde un estado proinflamatorio activado hacia un fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado y los monocitos/macrófagos expresan características antiinflamatorias/tolerogénicas esenciales para la reparación tisular.

La NMP en 34 hígados de donantes humanos incluidos en este estudio transcurrió sin incidentes y permitió la evaluación repetida de muestras de tejido y perfusión sin impacto en la integridad del órgano. Los neutrófilos se identificaron como la transcriptómica sc basada en la población de células inmunitarias más prevalente realizada en ocho hígados de donantes. El análisis multiplex IF e IHC corroboró que los neutrófilos CD15+ son el tipo de célula inmunitaria hepática dominante, distribuidos por todo el órgano en un patrón manchado. Curiosamente, hasta donde sabemos, el linaje de neutrófilos se descarta por completo en los conjuntos de datos de scRNASeq publicados hasta ahora de hígados humanos17,18,19,22,23,24,74. Lo más probable es que esta discrepancia se atribuya a errores metodológicos más que a un fenómeno biológico. Debido a que los neutrófilos son un tipo de célula extremadamente frágil y de vida notablemente corta75 que es particularmente sensible a la disociación y clasificación de tejidos, un flujo de trabajo rápido pero suave desde la disociación de tejidos hasta la lisis celular es esencial para preservar estas células. Además, los neutrófilos expresan una cantidad excepcionalmente baja de moléculas de ARNm76, lo que impide su recuperación en los datos de scRNASeq. Recientemente demostramos que los neutrófilos no se pueden detectar adecuadamente en los conjuntos de datos generados con la plataforma de secuenciación 10x Chromium basada en gotas y solo en una medida muy limitada con otras plataformas. Sin embargo, la plataforma scRNASeq basada en micropocillos aplicada en este estudio permite capturar cantidades relativamente altas de moléculas de ARNm por célula y, por lo tanto, mejora la recuperación de células con bajo contenido de ARNm26. Si bien scRNASeq de ocho hígados generó un gran conjunto de datos, el número total y el espectro de diferencias en la calidad del hígado siguen siendo una limitación. Aunque incluimos hígados ECD en este estudio, los órganos pueden variar en la calidad del injerto y la enfermedad/daño preexistente, lo que hace que sea imposible capturar la amplitud total de la variación interindividual en este esfuerzo.

Se ha demostrado que los circuitos inflamatorios impulsados ​​por neutrófilos, como se observa en nuestros perfundidos de NMP, promueven diversas patologías hepáticas agudas y crónicas77. Al igual que los neutrófilos, los monocitos/macrófagos son reguladores clave de la homeostasis tisular y la activación inmunitaria en el hígado78. Aquí proporcionamos evidencia de que NMP desencadena un cambio de neutrófilos altamente activados hacia un fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado en hígados humanos. Específicamente, la activación de neutrófilos por NMP se refleja en la inducción del eje IL-8/CXCR1/2, que contribuye al microambiente proinflamatorio. Esto también puede conducir a la formación inducida de NET que resulta en un agravamiento de la IRI79 hepática. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de CXCR1/2 durante la activación de los neutrófilos puede ayudar a limitar una respuesta inflamatoria excesiva durante la NMP.

La dinámica de los monocitos/macrófagos durante la NMP no puede describirse sin ambigüedades como un fenotipo pro o antiinflamatorio, sino que indica una secuencia de respuesta y contrarrespuesta. Esto también se refleja en el análisis de subgrupos que demuestra que los monocitos/macrófagos proinflamatorios disminuyen, mientras que los subtipos antiinflamatorios y tolerogénicos ("similares a M2") involucrados en la proliferación celular, la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la reparación de tejidos aumentan significativamente durante NMP, respectivamente.

La comprensión actual del impacto de la NMP (y la perfusión mecánica en general) en el perfil inflamatorio/repertorio de células inmunitarias de un órgano es limitada80. En hígados de rata, se demostró que los patrones moleculares asociados al daño (DAMP) inducen daño tisular durante la perfusión mecánica81. En un modelo similar, se demostró que la NMP induce una amplia firma de expresión génica inflamatoria y la activación de las células inmunitarias residentes en el hígado. El tratamiento con IL-10 y factor de crecimiento transformante (TGF)-ß resultó en la moderación de la inflamación en este modelo82. En un estudio realizado en hígados humanos, la NMP inhibió la inflamación y promovió la regeneración del injerto83.

De acuerdo con la expresión mejorada de citoquinas observada en seis hígados durante 6 h NMP por Lee et al., encontramos expresión de citoquinas tanto proinflamatorias como antiinflamatorias en el perfusato83. La acumulación de interleucinas/quimiocinas en el perfundido coincide con los cambios transcriptómicos en neutrófilos y monocitos/macrófagos en el parénquima hepático. Un aumento significativo de IL-6 en perfusión de injertos DCD e hígados descartados puede ser indicativo de una respuesta inflamatoria más pronunciada en estos órganos. De hecho, Ohman et al.84 informaron recientemente que la respuesta inmune en hígados de baja calidad/funcionamiento inferior difería de los injertos funcionales cuando se sometieron a NMP, aunque se informaron niveles exorbitantes de perfusión de IL-6 para ambos grupos. Por lo tanto, nuestras observaciones requieren mayor atención antes de la determinación de su importancia clínica.

La movilización de leucocitos y en particular de neutrófilos y la transición al perfundido fue extremadamente rápida. Esto es consistente con los datos de pulmones y riñones porcinos durante NMP. En estos estudios, la migración excesiva también se relacionó con una inmunogenicidad reducida con tasas de rechazo agudo más bajas13,14. En este documento describimos las células inmunitarias perfundidas con gran detalle y brindamos información sobre los cambios dinámicos para una perfusión de hasta 24 h en una cohorte de 26 hígados humanos. Mientras que un número significativo de células estaba presente en el perfundido al final de NMP en nuestro estudio, la disminución de la mayoría de los tipos de células con el tiempo de perfusión parece indicar la mitigación de este efecto. Alternativamente, las células inmunitarias circulantes pueden migrar de regreso al hígado. Estudios de seguimiento más detallados y futuros de las células inmunitarias entre el tejido y el perfundido iluminarán este proceso dinámico con más detalle.

Además, la modulación de este proceso, por ejemplo mediante la movilización activa de leucocitos y/o la eliminación de leucocitos, puede reducir la carga antigénica/inflamatoria del hígado durante la NMP. Sin embargo, la retirada indiscriminada puede no ser ideal, ya que los subconjuntos de células inmunitarias circulantes también están implicados en la regeneración de tejidos, la remodelación de tejidos, la curación y la inducción de tolerancia80. Como ejemplo, demostramos una fuerte inducción de un fenotipo antiinflamatorio "similar a M2" en monocitos/macrófagos durante NMP. Esto puede fomentar los mecanismos de reparación y remodelación de tejidos y, por lo tanto, sugerimos una eliminación más específica de los subconjuntos de células inmunitarias inflamatorias y potencialmente dañinas para los tejidos. Aquí, sugerimos que la orientación selectiva de los neutrófilos proinflamatorios (por ejemplo, por los antagonistas de CXCR2) podría ser un primer paso hacia la inmunomodulación dirigida durante la perfusión ex vivo. Además, la filtración de citocinas proinflamatorias durante la NMP también podría ser beneficiosa. Los primeros resultados de un ensayo de perfusión de riñón humano indicaron un efecto positivo en las firmas de expresión génica asociadas a la función del injerto retardado85.

En conclusión, nuestro análisis integral destaca la dinámica del repertorio de células inmunitarias hepáticas durante la NMP de hígados humanos a nivel transcriptómico y proteico. El mapeo en profundidad de las células inmunitarias reveló el predominio de los neutrófilos en los hígados de donantes humanos. Junto con una variedad de otras poblaciones de células inmunitarias, estas células transmigran rápidamente en gran medida al perfundido durante la NMP hepática. Con la prolongación de la perfusión, el estado de activación de las células inmunitarias diverge de un fenotipo proinflamatorio a un fenotipo agotado pero también regenerativo. Nuestros hallazgos y los conjuntos de datos correspondientes pueden servir como base para futuros estudios de intervención y abrir nuevas vías para mitigar la inflamación mediante inmunomodulación dirigida durante NMP y LT.

Esta investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes. El estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional (protocolo n.º 1175/2018) de la Universidad Médica de Innsbruck. Previamente se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

Entre abril de 2019 y julio de 2021, se inscribieron un total de 34 hígados de donantes sometidos a NMP. Todos los órganos fueron aceptados con la intención de trasplantar después de NMP. Los hígados se enjuagaron durante la recuperación utilizando la solución de la Universidad de Wisconsin (UW, n = 14) o histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK, n = 20) y se enviaron según las condiciones estándar de almacenamiento en frío utilizando el mismo líquido de conservación en hielo. Después del transporte a nuestra institución (concepto de regreso a la base), los hígados se perfundieron utilizando el dispositivo OrganOx metra de acuerdo con los protocolos locales2. Al llegar a nuestro centro, los injertos se enjuagaron con 2000 ml de HTK para eliminar cualquier resto de células sanguíneas. A continuación, los hígados se prepararon quirúrgicamente para NMP y se conectaron a la máquina de perfusión. El perfundido de NMP constaba de tres unidades de glóbulos rojos empaquetados (RBC, 300 ml cada uno) sin leucocitos tipo O (irradiación de 30 Gy), 500 ml de Gelofusine (B. Braun) y aditivos según el protocolo del fabricante. De acuerdo con las normas locales, una unidad empaquetada de bolsa de glóbulos rojos sin leucocitos contiene un máximo de 1 × 106 leucocitos. Se aplicó un protocolo estandarizado para NMP que incluye un esquema para análisis de perfusión como se estableció recientemente en nuestra institución2. Esto incluye un enfoque multidisciplinario con observación y manejo de órganos en la UCI. La decisión de trasplantar o descartar un órgano se basó en la disminución del lactato, el mantenimiento del pH y el consumo de glucosa. El mantenimiento de los valores de pH fisiológico (7,3-7,45) sin suplementos de bicarbonato de sodio después de 2 h de NMP, así como una rápida disminución y mantenimiento del lactato a niveles fisiológicos (≤18 mg/dl) se consideran factores clave que indican una buena función orgánica. Además de esto, los niveles excepcionalmente altos de AST, ALT y lactato deshidrogenasa (>10.000 U/l) y una fuerte inclinación de estos parámetros se consideran señales de advertencia. Los receptores de hígado incluidos en el estudio fueron adultos ≥ 18 años, listados para un primer trasplante o un retrasplante.

De 34 hígados de donantes sometidos a NMP, se realizó un análisis de scRNASeq en ocho hígados de estudio seleccionados al azar. Por lo tanto, las muestras de biopsia de hígado en cuña se recogieron en tres momentos individuales, es decir, antes de la NMP (T0), al final de la NMP (T1) y después de la reperfusión (T2) si se trasplantaba. Se recolectaron muestras de perfusión en serie de otros 26 hígados de estudio a las 1, 4, 6, 12 h y al final de NMP para la cuantificación celular/fenotipado y evaluación de citocinas mediante citometría de flujo y análisis Luminex. En la Fig. 1 se proporciona información detallada sobre el número de muestras, la recolección de tejido/perfundido, los puntos de tiempo y el tipo de análisis.

Las biopsias de hígado tomadas antes (T0) y al final (T1) de NMP, así como después de la reperfusión (T2) (n = 8 hígados) se picaron inmediatamente en pequeños trozos (<1 mm) en hielo y posteriormente se digirieron enzimáticamente durante 10 min. a 37 °C con agitación usando el reactivo de disociación BD TuDoR (BD Biosciences). La suspensión de células individuales se filtró a través de un filtro de células de 100 µM y los glóbulos rojos se eliminaron con la solución de lisis BD Pharm Lyse (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se midió con la plataforma BD Rhapsody scRNASeq (BD Biosciences) usando Calcein-AM (Thermo Fisher Scientific) y Draq7 (BD Biosciences).

La suspensión de una sola célula recién aislada se procesó inmediatamente (<30 min desde la disociación del tejido hasta la lisis celular) y se generaron bibliotecas de secuenciación de amplificación de transcriptoma completo (WTA) de acuerdo con el protocolo WTA de una sola célula de BD Rhapsody. Seleccionamos la plataforma BD Rhapsody scRNASeq basada en micropocillos con la intención de deconvolucionar de manera integral la dinámica de los leucocitos, ya que permite representar células con bajo contenido de ARNm (p. ej., neutrófilos) y puede conducir a la pérdida de células grandes >40 µm (hepatocitos) debido a un fenómeno de exclusión de perlas. La calidad de las bibliotecas de secuenciación obtenidas se verificó con el sistema 4200 TapeStation (Agilent) y el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realizó en la plataforma del sistema NovaSeq 6000 (Illumina) con el S1 Reagent Kit v1.5 (200 ciclos, lectura de índice de 68 pb 1; Illumina) a una profundidad de secuenciación calculada de 50 000 lecturas/célula.

El preprocesamiento bioinformático de los archivos de secuenciación FastQ obtenidos se realizó a través del entorno Seven Bridges Platform basado en la nube (Seven Bridges Genomics) utilizando la aplicación BD Rhapsody WTA Analysis Pipeline. Los datos se cargaron en AnnData86 para su posterior procesamiento con herramientas scverse. El control de calidad se realizó con scanpy87, reteniendo solo células con (1) entre 250 y 8000 genes detectados, (2) entre 1000 y 100 000 transcritos y (3) <30 % de transcritos mitocondriales. Los 4000 genes más altamente variables (HVG) se seleccionaron utilizando la función high_variable_genes de scanpy con las opciones flavor = "seurat_v3" y batch_key = "paciente". Los transcriptomas celulares se incrustaron en un espacio latente de baja dimensión corregido por lotes usando scVI88,89, tratando cada muestra como un lote separado. Los dobletes se identificaron y eliminaron usando SOLO90 como se implementó en scvi-tools89. Se calcularon un gráfico de vecindario y una proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP)91 basados ​​en el espacio latente scVI. Los tipos de células se anotaron en función de la agrupación no supervisada con el algoritmo de Leiden92 y genes marcadores conocidos.

Usamos DESeq293 en muestras pseudoa granel para pruebas de expresión diferencial que se ha demostrado que funciona bien y corrige adecuadamente los descubrimientos falsos94. Para cada tipo de célula y paciente, resumimos los recuentos de transcritos para cada gen que se expresa en al menos el 5 % de las células que utilizan el desacoplador-py95. Se descartaron las muestras a granel que consistían en menos de 1000 recuentos o 10 células. Los valores de p se ajustaron para pruebas de hipótesis múltiples con ponderación de hipótesis independiente (IHW)96. Los genes marcadores para subgrupos de monocitos/macrófagos y neutrófilos se determinaron usando el área bajo la curva de características del operador del receptor (AUROC) y métricas de cambio de pliegue log2 en muestras pseudoa granel como se define en Becht et al.91. Los genes marcadores se definieron por tener un AUROC > 0,7 y un cambio de veces log2 > 1 para neutrófilos y > 2 para monocitos/macrófagos.

Realizamos un análisis del factor de transcripción con DoROthEA97 utilizando un modelo lineal multivariante implementado en desacoplador-py95. Solo se utilizaron los regulones con los niveles de confianza más altos "A" y "B". Los cambios de pliegue del análisis DESeq2 se utilizaron como entrada. Además, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes utilizando una prueba de representación excesiva (ORA, es decir, la prueba exacta de Fisher) implementada en desacoplador-py. Las comparaciones de DE entre diferentes tipos de células tienen un poder estadístico diferente debido a un número diferente de muestras pseudoa granel. Para evitar sesgos debido a diferentes números de genes expresados ​​diferencialmente por tipo de célula, utilizamos los 182 expresados ​​de manera más diferencial para cada tipo de célula para la prueba de sobrerrepresentación, que corresponde a la mediana del número de genes DE en todos los tipos de células en un Tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,01 y |log2 veces el cambio | > 1.

Utilizamos la base de datos CellChat29 obtenida de omnipathdb29 para investigar las diferencias en la comunicación de célula a célula entre puntos de tiempo. El algoritmo CellChatDB original está diseñado para encontrar diferencias entre los tipos de células. Para nuestro estudio, por otro lado, estábamos interesados ​​en las diferencias entre puntos de tiempo, utilizando pacientes como réplicas biológicas. Por lo tanto, para cada tipo de célula de interés, consideramos la lista de ligandos expresados ​​de manera significativamente diferencial en CellChatDB. Para cada una de esas moléculas de señalización expresadas diferencialmente y para cada tipo de célula, determinamos socios de interacción que se ven potencialmente afectados por ese cambio, como aquellos que se expresan en al menos el 10% de las células en un determinado tipo de célula. Las moléculas de señalización expresadas diferencialmente se determinaron con DESeq2 como se describe anteriormente. La fracción de células que expresan una molécula de señalización se calculó como la media de fracciones por paciente, para evitar sesgos debido a diferentes recuentos de células por paciente.

Las biopsias de hígado tomadas antes (T0) y al final (T1) de NMP (n = 10 seleccionadas al azar de 26 hígados) se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se incluyeron en parafina. La tinción IF multiplexada se realizó en secciones de 4 µm utilizando el kit de inmunohistoquímica automatizado de 7 colores Opal (cat: NEL821001KT, Akoya Biosciences). Se configuró un panel de marcadores inmunes que incluía anticuerpos contra CD15, CD8, CD68, CD3, CD20, citoqueratina (Panel 1) y CD15, CXCR2 (Panel 2). Los marcadores se aplicaron secuencialmente y se emparejaron con los respectivos fluoróforos Opal (los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 7). La tinción se realizó mediante un sistema automatizado (BOND-RX; Leica Biosystems). Para visualizar los núcleos celulares, el tejido se tiñó con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI espectral, Akoya Biosciences). Los portaobjetos se escanearon con la estación de trabajo de patología cuantitativa Mantra 2 (Akoya Biosciences) y el software Mantra Snap v1.0.4. Se adquirieron de cinco a ocho imágenes representativas de cada tejido para el análisis. La desmezcla espectral, el análisis de imágenes multiespectrales y el fenotipado celular se llevaron a cabo utilizando el software de análisis de tejidos inForm v2.4.10 (Akoya Biosciences). Se cuantificó la densidad de células inmunitarias y se da como "número de células/mm2". Se utilizó la prueba t pareada para evaluar las diferencias entre los dos grupos. En el análisis agrupado, los puntos de datos se presentan en diagramas de dispersión con medias ± error estándar de la media (SEM). Los análisis se realizaron con GraphPad Prism v6.0.

Las células aisladas de biopsias de hígado antes de la NMP (T0) y al final de la NMP (T1) se tiñeron con un cóctel de 19 anticuerpos (Tabla complementaria 8) en concentraciones pretituladas y, después del lavado y la adición de 7-AAD, se midieron. en un citómetro de flujo FACSymphony A5. Los datos se analizaron con el software FlowJo v10.7 (para obtener detalles de la estrategia de activación, consulte la Fig. 12 complementaria).

Se recogieron muestras seriadas de perfusión de 26 hígados sometidos a NMP (5 ml) en tubos Cyto-Check BCT (Streck) a las 1, 4, 6, 12 h y al final de NMP. La fijación celular inmediata en estos tubos mantiene la morfología celular y la expresión del antígeno de superficie y permite el almacenamiento de muestras a temperatura ambiente al menos durante 5 días. En nuestro estudio se eligieron tubos de fijación para facilitar la logística. Se utilizaron 500 µl de perfusión para cada tinción. Inicialmente, se lisaron glóbulos rojos de 500 µl de perfusión con RBC Lysis Buffer (Thermo Scientific, eBioscience). Después del bloqueo con Fc Blocking Reagents (BD Bioscience), las células se incubaron con las mezclas maestras de anticuerpos en varias combinaciones que contenían los anticuerpos a los que se hace referencia en la Tabla complementaria 9. Para la tinción intracelular FoxP3, las células se permeabilizaron usando el juego de tampones de tinción Foxp3/Factor de transcripción ( Thermo Scientific, ebioscience) e incubado con suero de rata normal (Thermo Scientific, ebioscience) antes de la incubación con el anticuerpo FoxP3. Para la cuantificación del número absoluto de células, se usaron tubos BD Trucount (BD Bioscience) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se analizaron con un citómetro de flujo LSRFortessa (Becton Dickinson and Company). La exclusión de dobletes se logró trazando áreas de dispersión, alturas y anchos hacia adelante y hacia los lados (FSC- y SSC-A/-H/-W). Los datos se analizaron con FlowJo v6.2 (Tree Star). La estrategia de activación se presenta en las Figs. complementarias. 13–20. Para las pruebas de viabilidad celular, el perfundido se recogió al inicio de NMP, después de 1 h y al final de NMP (n = 5). Los glóbulos rojos se lisaron con tampón de lisis de RBC y los leucocitos se tiñeron con azul de tripán. Se contaron un mínimo de 150 células/muestra por duplicado, se promediaron los resultados y se calculó el porcentaje de células muertas/vivas.

Se centrifugaron muestras seriadas de perfusión de 26 hígados sometidos a NMP y se congelaron 500 µl de suero a -80 °C. Los niveles de proteína de citoquinas/quimioquinas se midieron utilizando el panel 1A de ProcartaPlex humano Cytokine&Chemokine 34‐Plex (EPX340-12167-901, Thermo Fisher Scientific) en un instrumento Luminex MAGPIX (Luminex Corporation) y se analizaron con el software xPonent 4.2 Rev.2 (Luminex Corporation) según protocolo del fabricante. El perfil de citocinas se leyó a la luz del tipo de donante (hígados DBD frente a DCD) y el estado del trasplante (hígados trasplantados frente a descartados).

Los datos de perfusión se expresan como valores absolutos o proporciones (%), promedios estimados ± desviación estándar (DE) e intervalo de confianza (IC) del 95 %. Se utilizó un modelo de efecto mixto lineal para medidas repetidas (LMM) para la dinámica de composición celular. Dada la distribución asimétrica positiva, se realizó una transformación logarítmica. Se usó ANOVA unidireccional para evaluar las diferencias teniendo en cuenta la perfusión general en el transcurso del tiempo. El análisis de expresión génica diferencial de una sola célula se realizó utilizando DESeq2 en muestras pseudoa granel agregadas por réplica biológica. Los análisis se realizaron con el software estadístico R (v4.0.3, Team RC, R Foundation for Statistical Computing)98. Los gráficos se completaron utilizando GraphPad Prism 9.1.0 (216). Los valores P para análisis no dirigidos (genes DE, TF, conjuntos de genes) se ajustaron con FDR. Los niveles de significación y más detalles sobre las pruebas estadísticas se indican en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuencia que respaldan los hallazgos de este estudio (todas las figuras) están disponibles a través de la entrada GSE216584 de NCBI GEO. Todos los demás datos están disponibles en el artículo y sus archivos complementarios o del autor correspondiente a pedido. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código fuente para reproducir el análisis de datos está disponible en https://github.com/icbi-lab/nmp-liver. Los datos de entrada procesados ​​y las dependencias de software en contenedores necesarias para ejecutar el código están disponibles en zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.7249006.

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Los autores desean agradecer a Astrid Drasche y Annabella Pittl por el apoyo técnico y al DI Wolfgang Peter por el apoyo estadístico. La investigación fue apoyada por el Fondo de Ciencias de Austria FWF (Subvención No. TAI-697) (DW), "In Memoriam Gabriel Salzner Stiftung" (SS, DW), Tiroler Wissenschaftsfond (TH), Jubiläumsfonds— Österreichische Nationalbank (RO), Subvención FFG Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación, 858057 (HD FACS, S.So.). GS fue apoyado por una beca DOC de la Academia de Ciencias de Austria. La autora Margot Fodor (MF) utilizará parte de los materiales y datos de este estudio para la realización de su Ph.D. tesis.

Estos autores contribuyeron igualmente: T. Hautz, S. Salcher, M. Fodor.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: D. Wolf, S. Schneeberger.

Departamento de Cirugía Visceral, Trasplante y Torácica, Centro de Medicina Operativa, Laboratorio organLife y Laboratorio de Investigación D. Swarovski, Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

, T. Hautz , M. Fodor , S. Ebner , B. Cardini , J. Hofmann , T. Resch , F. Krendl , A. Weissenbacher , G. Otarashvili , D. Öfner , J. Troppmair , R. Oberhuber & S .Schneeberger

Departamento de Medicina Interna V, Hematología y Oncología, Centro Integral del Cáncer Innsbruck (CCCI), Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

Salcher S, Mair A, Trebo M, Untergasser G, Sopper S, Martowicz A, Daum S, Kalb M, Pircher A y Wolf D

Instituto de Bioinformática, Biocenter, Medical University of Innsbruck, Innsbruck, Austria

G. Sturm y Z. Trajanoski

Tyrolpath Obrist Brunhuber GmbH, Zams, Austria

G. Untergasser, A. Martowicz & P. ​​Obrist

Instituto de Patología, Neuropatología y Patología Molecular, Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

B.Zelger

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Conceptualización y diseño del estudio (TH, RO, AP, DW, S.Sc.), recopilación de datos (MF, BC, JH, TR, FK, AW, GO, RO, AP), realización de secuenciación de sc-RNA y análisis de datos ( S.Sa., GS, GU, A.Mai., MT, S.So., MK), realizó análisis de citometría de flujo y analizó datos (SE, MF, TH, S.So.), realizó Luminex y analizó datos ( MF, TH), patología y análisis microscópicos (A.Mar., PO, BZ), visualización (S.Sa., MF, GU, A.Mar., SD, D.Ö., ZT, JT), escribió original borrador (TH, S.Sa., MF), revisión y edición final del artículo (todos). OR, PA, WD y SS contribuyeron por igual como autores principales.

Correspondencia a D. Wolf o S. Schneeberger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Damien Chaussabel y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Hautz, T., Salcher, S., Fodor, M. et al. Dinámica de células inmunitarias desconvolucionada por secuenciación de ARN de una sola célula en máquina de perfusión normotérmica del hígado. Nat Comun 14, 2285 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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Recibido: 22 febrero 2022

Aceptado: 27 de marzo de 2023

Publicado: 21 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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